双孢蘑菇耐温相关基因片段的分析
宋思扬 陈兰芬 郑忠辉 苏文金
（厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部开放实验室 厦门 361005）
陈美元 廖剑华 王泽生
（福建省轻工业研究所 福州 350005）
摘要 应用RT-RAPD技术，以6bp随机引物反转录双孢蘑菇（Agaricus bisporus）02菌株常温培养和高温诱导菌丝体的总RNA，10bp随机引物PCR扩增，得到几个高温诱导差异片段，对U13引物的差异片段02U13克隆并测序，发现该片段编码tRNAVal（密码子GUC）基因。我们推测GUC可能是稀有密码子，在某些耐温基因中出现频率较高。识别该稀有密码子的tRNAVal在常温条件下不表达或表达量很少，而在高温诱导下引发一定的调控机制促使它们大量的合成，进一步引发相关的耐温基因表达。
关键词 双孢蘑菇，RT-RAPD, 耐温相关基因，tRNAVal
分类号
双孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange (Imbach)]是一种富有营养的、具有很高经济价值和重要生态意义的栽培食用菌。双孢蘑菇属于稳温结实性的菌类。温度是影响其生长的主要因素。在蘑菇种植产业的发展中，控温培养（15℃～24℃）使栽培成本升高，这一问题在我国南方尤其突出，也是造成双孢蘑菇季节性栽培的主要原因[1]。加强和深化双孢蘑菇的分子生物学研究，特别是充分运用现代生物技术寻找耐高温基因并转入蘑菇菌体以培育抗高温，高产，优质的新菌株，具有十分重要的理论和实践意义。
本文采用的RT-RAPD方法[2]与Peng Liang[3]和Strauss[4]建立的DDRT-PCR方法相类似，所不同的是利用6bp随机引物而不是寡聚T进行反转录，反转录产物再用随机引物进行PCR扩增，扩增产物直接用琼脂糖凝胶电泳进行分析，操作较为简便。而且该方法可以对总RNA进行随机扩增，以获得差异表达的功能性基因。
1 材料和方法
1.1 材料
菌株：双孢蘑菇菌株02，由福建省轻工业研究所蘑菇菌种研究推广站提供。菌株培养用常规PDA培养基。大肠杆菌(Escherichia coli): DH5a菌株为本实验室保存菌株。
1.2 方法
1.2.1双孢蘑菇的常温培养：24 oC条件下，培养两周的液体PDA培养物。
高温诱导培养：将常温培养后生长良好的菌丝的PDA液体培养物放入32 oC培养箱中诱导培养12h。
1.2.2总RNA提取：CsCl 密度梯度离心方法[5]。
1.2.3 RNA样品中DNA的去除：按考文献[6]方法进行。
1.2.4 RNA的6碱基随机引物反转录： 19μL含10μg无DNA的RNA,65 水浴10 min后, 加入5×RT buffer 8μL; DTT (100mmol/L)4μL; dNTPs (10mmol/L)2μL; 6随机引物(50ng/μL) 5μL; M-MLV反转录酶(200U/μL) 2μL。(以上试剂均为美国Promega公司产品)。反应条件：22℃ 10min; 37℃ 60min; 70℃ 60min; 4℃保存。
1.2.5 1.2.5 反转录产物的RAPD扩增：参照文献[7]方法进行。30μL PCR反应体系中含上述反转录产物１μL；10×PCR buffer 3μL; MgCl (25 mmol/L) 2μL; dNTPs (5mmol/L)1.5μL; 10碱基随机引物（100 pmol/L）1; Taq酶（1U/μL）1.5μL; PCR用水补足余下体积。福建（以上试剂中引物为上海Sangon产品外，其它均为美国Promega公司产品）。反应条件94 预变性2min; 之后进行42个以下循环：94℃1min; 38℃2min; 72℃1min; 最后72℃继续延伸15min。
1.2.6 1.2.6 电泳：采用TAE缓冲系统，琼脂糖凝胶浓度1.4%, PCR产物加量10μL,电压8V/cm,电泳结果由EB染色得到。
1.2.7 1.2.7 差异片段的克隆和测序：按参考文献[5]的方法，将差异片段克隆于pUCm-T载体。克隆子交上海Sangon测序。
2 2 结果
2.1 2.1 02 菌株不同温度（24℃和32℃）的RT-RAPD扩增图谱
双孢蘑菇菌株０２常温（24℃）培养及在高温（32℃）诱导培养12h后分别提取总RNA。用RNase-free的DNaseⅠ消化去除DNA，甲醛变性凝胶电泳确定为无降解的总RNA。经6 bp随机引物反转录成cDNA第一链后，本实验用约二十种10 bp随机引物分别进行PCR扩增，1.4%琼脂糖电泳观察RAPD条带。其中OPU8、OPU12、OPU13、OPU19引物（引物序列见表１）扩增的RAPD图谱中有差异条带出现（图１）。OPU8、OPU12 、OPU13的差异条带是出现在诱导后的样品中，而OPU19的差异带则是在常温培养的样品中。结果都经两次重复。
表１ 10 随机引物编号及核苷酸序列
Table １ Commercial number and DNA sequences of random primers
编 号Number 核苷酸序列(5’®3’)Sequence of primers 编号Number 核苷酸序列(5’®3’)Sequence of primers
OPU08 GGCGAAGGTT OPU12 TCACCAGCCA
OPU13 GGCTGGTTCC OPU19 GTCAGTGCGG
2.2 02菌株OPU13差异片段的克隆及序列分析
从上述的差异条带中选取02菌株的OPU13 扩增产物中一条差异带，分子量大约是525bp，命名为02U13，用OPU13作引物进行再次PCR扩增，获得足够浓度和纯度的目的基因片断。用T4 连接酶将目的片段与pUCm-T载体直接连接，用于转化感受态大肠杆菌DH5α,采用蓝/白筛选，及选用目的片段上无内切酶位点的限制性内切酶Sac I 和 BamH I 限制性内切酶作双酶切鉴定，获得含02U13差异片段的重组克隆子。
将含有目的差异片段的克隆子交上海生工生物工程有限服务公司测序。测序结果见图2，序列的二级结构分析见图3。该序列用BLAST 软件与GENBANK中已知序列进行比较,没有发现值得注意的同源序列，用DNASIS软件对该序列所有可能编码的阅读框进行分析，发现三种可能的编码方式中均存在几个短序列的完整阅读框，我们认为该片段不太可能是蛋白质的编码序列。对该序列进行二级结构分析发现该序列的一部分（No.27～No.115）可能是转运Val的tRNA。
3讨论
我们采用了RT-RAPD方法获得与耐热相关的DNA片段[2]。该方法不同与Peng Liang[3]和Strauss[4]建立的DDRT-PCR方法，它采用6bp随机引物而不是寡聚T进行反转录，反转录产物再用随机引物进行PCR扩增，扩增产物直接用琼脂糖凝胶电泳进行分析，而不需要使用放射性同位素，也不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，操作较为简便。该方法也可以对总RNA进行随机扩增。但是这种方法也存在一定的局限性，某些看似有和无的特异表达的条带，可能只是表达量增加的序列；同时普通琼脂糖电泳的分辨率也有限，某些差异条带可能会被周围的高浓度的其他条带所掩盖；而且有时在琼脂糖上看似一条的差异带，有可能事实上是多条DNA片段整合在一起的。因此为慎重起见，得到的差异条带，还应该多次证实其
24℃ 32℃ Marker 24℃ 32℃ Marker
21226 21226
5148 5148
4973 4973
4268 4268
3530 3530
2027 2027
1904 1904
1584 1584
1375 1375
947 947
831 831
564 564
A B
24℃ 32℃ Marker 24℃ 32℃ Marker
21226 21226
5148 5148
4973 4973
4268 4268
3530 3530
2027 2027
1904 1904
1584 1584
1375 1375
947 947
831 831
564 564
C D
图１ 02菌株不同温度（24℃和32℃）培养的RT-RAPD扩增图谱
FIG.1 Amplification pattern of RT-RAPD of stain 02 cultured in different temperature（24℃ and 32℃）
Marker:λ DNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ marker
A、B、C、D ：Random primer OPU8 、OPU12、 OPU13 、OPU19 respectively
The differential fragments are marked with arrows
1 GGCGGCCGCC TGCAGACCAG GTCTGGCTGG TTCCATGGGA ACGACTACCA GCACCGACAG
61 TGCTCTGGGC GTAGATCCAG CAGTAAAGAG GACCACGACA TCAGGTGCGA GCAAGCGGAT
121 ATGATCGACC ATACCGGGCG AGGAACATAC TCATACAAGA TCCACGATAC GTCCAGTTGA
181 TTCAGGCTCT GGCGAAGAGG CTTGAGTATG CGTAAGAGCA GGTGTCGTAG GCGCTTTCTC
241 GGAGGGAGTC ATAACTTGAA GGAGGCAAAG GAAAAATACA ACTCCAACTA TGCCTGCCAG
301 TGGGATGGCG ATGGTGGAAC CAATCCGCGA GAGCGCAATG AACAACCAGT GGCCAAAGAA
361 AGATAGCATC CCCCAGGTAA AAGAGGCACC TGGAGCTGCG AATATGAGCG CAACCTTCTG
421 GAATTTATAT TTCCTGAGAA CTTGACTATG GAACCAGCCA AGACTGGAGA TCTGGATCCC
481 TCGAGTCTAG AGTCGACCTG CAGGCATGCA AGCTTGGCGT AATCA
图2 02U13的DNA序列
5' C-G 3'
U-A
G A
G-C
U+G
U-A
C-G ACUA
C CGUGG
A A ! ! ! !
GGGU GGACC C
A ! + ! A ACGA
C ACUA G
G C A
C CU A
A-U G A
G-C G U
C-G G G
A-U C A
C G G C
C A U G
GAC A A
G C
A
U C
图3 02U13序列（No.27～No.115）的二级结构分析
Fig.3 Analysis the secondary structure of 02U13 sequence
可重复性。
由于考虑到与高温诱导相关的序列并不局限于可翻译为蛋白质的结构基因,它也有可能是rRNA、tRNA 或其他一些功能性的序列，因此本实验采用总RNA作为反转录模板，并用6bp随机引物反转录，在严格地去除DNA的污染，以免污染DNA干扰实验结果的情况下，用6 bp随机引物反转录，并用10 bp随机引物进行PCR扩增，得到了可重复的多个差异条带，对其中一个片段进行克隆并分析其序列特点，对其二级结构分析发现它可能是一个携带Val的tRNA。
高温诱导与tRNAVal的特异表达有什么相关性？我们猜测，有可能该tRNA相应的密码子GUC是作为稀有密码子在高温诱导的蛋白质表达中起调控作用的。在不同的结构基因中所用的密码子可能会有很大的变化，同一种氨基酸的不同密码子在不同基因中的使用频率可能不同。编码某些蛋白质的基因内存在一般情况下较少使用的所谓稀有密码子，由于稀有密码子相对应的同功tRNA在细胞内的数量较少，因此在翻译过程中延长了核糖体在该mRNA上行经的时间，从而降低了翻译速度，使得富含稀有密码子的基因处于不表达或低水平表达的状态，因此该基因编码的蛋白质完全没有或数量较少[8]。而在一定条件下，如果稀有密码子相应的tRNA在胞质中的含量增加，就可能促使原先表达量较少或不表达的蛋白质表达量增加，以发挥特定条件下的特定功能。在大肠杆菌中编码Val的GUC密码子是作为稀有密码子使用的，在某些核糖体蛋白质中编码Val的GUC出现频率只有5.17%（在四个Val的密码子中，GUU使用了54次、GUA为40次、GUG为16次、而GUC只使用了6次），但它在哺乳动物基因中的出现频率是68.3%（在四个Val的密码子中，GUU使用了9次、GUA为5次、GUG为33次、GUC为21次），不是稀有密码子[9]。至于在双孢蘑菇中该密码子是否是稀有密码子，还未见到相关报道。如果在双孢蘑菇中它确实是稀有密码子的话，那么我们可以推测在高温条件下，高温诱导表达耐温相关基因，在这些基因中该稀有密码子的出现频率较高，因而常温条件下不表达或表达量很少，而在高温诱导下引发一定的调控机制促使了识别该稀有密码子的tRNAVal的大量合成，进一步促使了耐温相关基因的表达。
参 考 文 献
[1] 王泽生 编著 双孢蘑菇规范化集约化栽培技术。福建省科学技术协会编，1998，pp13～14
[2]Sokolov B. P. and Prockop D. J. A rapid and simple PCR-based method for isolation of cDNAs from differentially expressed genes. Nucleic Acids Research，1994，22(19) 4009～4015
[3]Liang P. and Arthur B. Pardee. Differential display of Eukaryotic Messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science，1992，257: 967～970
[4].Strauss M., Bauer D. and Muller H. Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display techniquel DDRT-PCR. Nucleic Acid Res，1993，21: 4272～4280
[5] Sambrook J., Fritsch E. F. and Manistis T. Molecular cloning, a laboratory manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989
[6]Liang P., Averboukh L. and Arthur B. Pardee. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acid Res，1993，21: 3269～3275
[7] Khush R. S., Becker E. and Wach M. DNA Amplification Polymorphisms of the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Appl Environ Microbiol.. 1992, 58:2971～2977
[8] 杨岐生 编著. 分子生物学基础。浙江大学出版社，1994，pp. 217
[9] 孙乃恩，孙东旭，朱德煦 编著. 分子遗传学。南京大学出版社，1996，pp. 251～254
Analysis of Agaricus bisporus Themotolerance related gene
Song Siyang, Chen Lanfen, Zheng Zhonghui, Su Wenjin
( The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, School of Life Science,Xiamen University, Xiamen, 361005 P.R.CHINA)
Chen Meiyuan, liao jianhua, Wang Zesheng
(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, Fujian,350005, P.R.CHINA)
ABSTRACT Using the RT-RAPD method, total RNA was reverse-transcripted with 6bp random primer, then cDNA was amplified by PCR with 10bp random primer. Several related thermotolerance DNA fragments of strain 02 were obtained. The fragment 02U13 with OPU13 random primer was cloned and sequenced . We found that 02U13 is probable a gene fragment of tRNAVal. GUC may be a rare codon, and it is abundant in some related themotolerance genes. The gene of tRNAVal for GUC is silence or low activity at normal temperature. But it express actively when the organism was induced at high temperature, and result of the high expression of the themotolerance related genes.
KEY WORDS Agaricus bisporus, RT-RAPD, Themotolerance related gene, tRNAVal
