双孢蘑菇A41基因组文库的构建及筛选
陈美元 王泽生 廖剑华 郭仲杰 卢政辉 李洪荣
(福建省轻工业研究所，福州，350005)
摘要：双孢蘑菇丛生菌株A41基因组DNA用Sau3AI部分酶切后克隆到EMBL3载体中，构建了该菌株的基因组文库，其滴度为2.2×105pfu/ml，插入片段平均长度为12.6Kb。用地高辛标记的DLDH(二氢硫辛酰胺脱氢酶)基因探针对该文库进行筛选并获得一阳性克隆，经鉴定其插入片段约8.5Kb。
关键词：双孢蘑菇，基因组文库，构建，筛选，DLDH
双孢蘑菇具有重要的经济价值和很高的营养价值，被誉为二十一世纪的健康食品，国际年产量达到300多万吨，是世界上最大宗的食用菌，对它的研究最多，其育种也已深入到分子水平。近年来，国内外对双孢蘑菇分子遗传学方面的研究有了较显著的进展[1]，成果主要集中在遗传标记、重复序列、转座子、系统发育、连锁分析、基因克隆、遗传转化等方面。就国内而言，本所发现了与菌株产质量性状相关的同工酶和RAPD标记[2，3]，克隆了与丛生变异相关的DNA片段[4]，并对国内种植最广的AS2796进行了家系的分子遗传分析[5]；厦门大学与我所合作克隆了一个质量相关DNA片段与几个耐热相关的基因片段[6，7]。总的来说，国内外对应用基因工程技术改良蘑菇品种特性进行了十多年的探索，在理论与技术上都取得了显著的进展，已转入有针对性的改良品种的应用研究，预计数年之后，蘑菇转基因的品种就可以问世，造福于人类。
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体[8]，完整的基因组文库的构建使任何DNA片段的筛选和获得成为可能，这是人们对生物体基因的结构、功能、表达及其调控进行深入研究的基础。通过筛选基因组文库或cDNA文库获得完整的基因，是应用基因工程手段改良品种的一个重要步骤，而其前提条件就是构建完整的基因文库(包括基因组文库和cDNA文库)。
1 材料与方法
1.1 菌株：双孢蘑菇丛生菌株A41由美国Sylvan公司提供，现保存于福建省蘑菇菌种研究推广站。
1.2 试剂：基因组克隆与包装试剂盒购自美国Promega公司，地高辛标记与检测试剂盒、尼龙膜购自德国BOEHRINGER MANNHEIM公司，DNA纯化试剂盒、Sau3AI、SalI、T4 DNA Ligase、RNaseA、DNaseI及其它试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.3 基因组DNA提取：按Sylvan公司提供的方法并加以改进。10克新鲜菇盖组织置滤
纸中挤干水分，加液氮磨碎，粉末移入15ml预冷的抽提缓冲液(100mM Tris-Cl, pH8.0; 50mM EDTA; 500mM NaCl; 20mM NaHSO3)中，旋涡振荡。加入2ml 10% SDS，充分混合，在65℃保温15min，加入5ml 5M KOAc，再次混合均匀，冰上放置20min。13000g离心20min后，上清通过两层纱布滤入10ml异丙醇中，沉淀的核酸用消毒玻棒缠绕出来，70%乙醇洗一次，空气中稍加干燥后于2ml TE(50mM Tris-Cl, pH8.0; 10mM EDTA; 25ug/ml RNaseA)中溶解过夜，酚/氯仿抽提一次，用0.1V 2.5M NaOAc(pH7.0)和0.7V异丙醇再次沉淀。最终的DNA悬浮于100ul TE中，4℃保存。
1.4 部分酶切及其产物纯化：200ul反应体系中含约20ug基因组DNA，0.1U Sau3AI，混匀后分装到10个小管中，于37℃水浴中保温，每隔5min取出一管加EDTA至终浓度10mM终止反应，最后用0.4%的琼脂糖凝胶电泳(电压2V/cm)检测其部分酶切效果，并据此进行大量酶切，酶切产物用DNA纯化试剂盒直接纯化。
1.5 基因组文库的构建：按照基因组克隆与包装试剂盒说明书进行。包括以下步骤：(1)部分酶切产物与载体EMBL3/BamHI Arms用T4 DNA Ligase进行连接；(2)连接产物与包装提取物进行体外包装；(3)包装产物梯度稀释后侵染感受态E.coli KW251；(4)铺平板培养进行文库的滴度测定。
1.6 基因组文库的扩增：按文献[9]的方法进行。
1.7 基因组文库的筛选：文库噬菌体稀释培养、噬菌斑影印到尼龙膜以及随后的变性及固定处理按照基因组克隆与包装试剂盒说明书进行。尼龙膜与地高辛标记探针的杂交及显色按照地高辛标记与检测试剂盒说明书进行。噬菌体DNA的提取按文献[9]的方法进行。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取：紫外分光测得总DNA的OD260/OD280约为1.5-1.6，说明还含有一些多糖等杂质。电泳图谱显示其质量良好，大部分DNA分子长度均达50Kb左右(图1)，其浓度估计为1ug/ul。
2.2 2.2 部分酶切及产物纯化：发现200ul反应体系中含约20ug基因组DNA，0.1U Sau3AI，37℃酶解15min时，可获得最佳的部分酶切效果，其20Kb DNA片段的比例较高(图1)。据此条件进行大规模酶解，酶解产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，并洗脱于适当体积的纯水中，使其终浓度约0.5ug/ul。
M 1 2 3 4 5
图1 A41基因组DNA部分酶切产物在0.4%琼脂糖凝胶上电泳分离图谱
Fig1 Patterns of partially digested genomic DNA of A41 separated on 0.4% Agarose gel
M道:λDNA Mix 19 Marker, 1道:无酶对照,2-5道:25,20,15, 10min部分酶解产物
Lane M:λDNA Mix 19 Marker, Lane 1:non-enzyme CK, Lane 2-5: Partially digested product of 25,20,15,10min, respectively
2.3 基因组文库的构建：纯化的部分酶切产物经连接、包装后，每60ul包装产物加入445ul 噬菌体稀释缓冲液，25ul 氯仿，5ul 1% 明胶，35ul DMSO，混匀后4℃保存。作103，104，105梯度稀释后铺平板测定滴度，得其平均滴度为2.2×105pfu/ml。随机提取4个噬菌斑DNA，用SalI进行酶切分析，其插入片段长度分别为8.5,8.9,13.0,20.0Kb，故该文库的平均插入片段长度为12.6Kb。由于双孢蘑菇基因组总长只有34Mb，根据公式N=ln(1-p)/ln(1-f)[10](其中p是希望得到该段DNA的机率，f是插入片段长度与基因组总长度的比值)，按插入片段12Kb，获得某基因片段机率99%计算，其基因文库所需重组噬菌体只要1.3×104个，所以即使考虑内切酶酶切位点的非随机性，我们所建的文库也应该是完整的。
2.4 基因组文库的筛选：使用735bp地高辛标记的DLDH基因(该基因已被证明可能与双孢蘑菇的丛生变异有关[4])探针对扩增后的文库进行筛选，从1500个噬菌斑中获得1个阳性克隆(图2)。挑取该克隆稀释后铺平板作进一步的杂交鉴定，所有噬斑均有杂交信号，证明其确为阳性克隆(图3)。提取该克隆的重组DNA，用SalI进行完全酶切，电泳结果显示该重组DNA被切为20.0, 9.0, 8.5Kb三条带(图4)，其中前二者分别为EMBL3载体的左右臂，而插入片段为8.5Kb。
图2 DLDH基因探针与A41基因组文库的杂交图谱 图3 DLDH基因探针与阳性克隆的杂交图谱
Fig2 Hybridization pattern of A41 genomic library with Fig3 Hybridization pattern of the positive clone
the probe of DLDH gene with the probe of DLDH gene
1 2 M
图4 阳性克隆重组DNA的SalI酶切图谱
Fig4 Band pattern of the recombinant DNA of the positive clone by SalI digestion
M道：λDNA/HindIII Marker，1道：重组DNA，2道：重组DNA/SalI
9.4Kb Lane M:λDNA/HindIII Marker, Lane 1:Recombinant DNA, Lane 2:
6.6Kb Recombinant DNA/SalI
3 讨论
一般真核生物基因组文库所要求的DNA插入片段长度为17-20Kb，这个长度包含完整真核基因的可能性较大。但这样对基因组DNA的质量要求较高，长度最好要达到80Kb以上。由于一些实验条件的限制，我们所采用的方法未能获得更高质量的基因组DNA，部分酶切后获得的带两个粘末端的20Kb DNA片段的比例较低，故纯化的20Kb片段经连接包装后难以获得满意的滴度。为得到较高滴度，我们直接纯化了20Kb片段比例较高的部分酶切产物，让EMBL3载体的包装范围(9-23Kb)对片段进行选择，最终构建了一个平均插入片段长度为12.6Kb的双孢蘑菇基因组文库。
DLDH在线粒体呼吸中起着非常重要的作用，我们的前期研究表明它可能与双孢蘑菇的丛生变异有关。通过DLDH基因片段探针的杂交筛选，我们获得了一个8.5Kb的DNA片段。在以后的研究中，我们希望通过筛选该文库能够获得完整的DLDH基因，进一步研究其与正常菌株的该基因是否存在差异，以确证它与丛生变异的相关性。
参考文献
1 A.S.M.Sonnenberg, 2000, Genetics and breeding of Agaricus bisporus, Mushroom Science, 15(1):25-39.
2 H.C.Wang et.al.,1989,The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis,Mushroom Science, 12(1):87-100.
3 陈美元，廖剑华，王泽生，1998，双孢蘑菇三种类型菌株的RAPD扩增研究，食用菌学报，5(4):6-10。
4 Zesheng Wang, Meiyuan Chen & Jianhua Liao, A Preliminary Study on the Molecular Mechanism of Clustering Variation of Agaricus bisporus, 2000, Proceedings of 1st Meeting for Fareast Asia Cooperation on Edible Fungi, Shanghai, China.
5 王泽生，廖剑华，陈美元等，2001，双孢蘑菇杂交菌株AS2796家系的分子遗传研究，菌物系统，20(2)：233-237。
6 曾伟，宋思扬，王泽生等，1999，双孢蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性RAPD分析，菌物系统，18(1)：55-60。
7 宋思扬，陈兰芬，郑忠辉等，2001，双孢蘑菇耐温相关基因片段的分析，待发表。
8 卢圣栋主编，1999，现代分子生物学实验技术(第二版)，中国协和医科大学出版社，北京，P295。
9 J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著(金冬雁，黎孟枫等译)，1992，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，北京，P160-161，P473。
10 魏群主编，1999，分子生物学实验指导，高等教育出版社，北京，P21。
Construction and Screening of the Genomic
Library of Agaricus bisporus A41
Meiyuan Chen Zesheng Wang Jianhua Liao Zhongjie Guo Zhenghui Lu Hongrong Li
(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005, P.R.China)
Abstract: The genomic DNA of the clustered strain A41 of A.bisporus was partially digested by Sau3AI and cloned into the vector EMBL3, and the genomic library of this strain was constructed with a titer of 2.2×105pfu/ml and an average size of 12.6Kb of the insert DNA. The library was screened with the Dig-labeled probe of DLDH (dihydrolipoamide dehydrogenase) gene and a positive clone with an insert DNA of 8.5Kb was obtained.
Keywords: Agaricus bisporus, Genomic library, Construction, Screening, DLDH
