第四节 菌种的生产
一、一级种的生产
一级种的生产指试管母种的扩大繁殖。一般由自己分离培养获得的母种，或从专门从事菌种研究部门引进的母种都要进行扩大繁殖，以增加母种数量，再用于繁殖原种。母种转管扩繁次数不宜过多，否则会降低菌种的生活力，影响产质量。对于没有母种生产经验缺乏母咱质量鉴别能力的制种单位，昼不进行一级种的生产。
１、培养基配制
（１）马铃薯葡萄糖培养基
①配方参见上述一级种培养基；
②制作方法：选择质量好的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成1-2 毫米厚薄片。称取200克,加水1000毫升,煮沸后,小火保持30分钟。然后用八层沾湿纱布过滤,滤液中加入预告浸泡拧干的琼脂,继续加热, 并不断用玻璃棒搅拌直至琼脂完全溶化,加葡萄糖搅匀,最后用清水补足至1000毫升,即可进行分装。
（２）综合马铃薯培养基
①配方参见上述一级种培养基；
②制作同PDA培养基,在加入葡萄糖同时加入磷酸氢二钾,硫酸镁,维生素B1等。
（３）堆肥浸汁葡萄糖培养基
①配方参见上述一级种培养基；
②制作方法：先把堆肥剪碎成1-2厘米长,加入水1000毫升煮沸后,用小火保持30 分钟,随后的过程同上。
２、分装
上述制备的母种培养基，趁热时尽快分装试管。用下口瓷量杯或用玻璃漏斗夹在滴定架上，下接一段乳胶管,用弹簧夹夹隹胶管,左手握试管, 右手控制培养基流量,使每支试管装量相当于试管长度的1/4左右。
３、塞棉塞：棉絮可用未经脱脂的原棉。一种方法是用手把棉絮做成棉塞塞入试管，松紧度以检查时用手抓隹棉塞不脱落为度。棉塞要紧贴管壁不起皱纹，棉塞塞入管中的部分约为２厘米左右，外露部分约占棉塞总长的1/3左右。 另一种方法是事先把棉絮用纱布包扎成塞子，规格是根据不同试管大小而定，松紧度以及塞入试管的要求同上。
４、灭菌：将制好的试管培养基用纱布包扎成一捆，在棉塞上盖上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞，随后放入手提式高压锅中进行灭菌，灭菌温度达121℃维持30分钟,具体操作要求参照高压蒸汽灭菌法。停火自然降压至零后， 打开高压锅盖。
５、摆斜面：将灭菌后的试管趁热放入摆斜面的专用木框内，木框底部前边支一小木块使之稍倾斜，使木框内的试管培养基摆成斜面，一般长度的为试管的2/3即可,摆好斜面后在上面盖一保温棉,防止试管冷却过快产生太多的冷凝水。
６、检验：制好的斜面要进行灭菌质量检查。随机抽取数根已灭菌的试管培养基放在28-30℃下进行三天空白培养,检查确实没有污染杂菌,斜面才能正式接种使用。
７、接种：接种前，把培养基放入接种箱中进行消毒，消毒要求按前述进行。接种时，手和接种针用75%的酒精棉球揩擦,点燃酒精灯,使火焰周围空间形成无菌区， 左手平行并排拿起母种试管和供接种用的斜面试管，两支试管斜面要向上，管口要齐平。右手大拇指和食指持接种针，在酒精火焰上灼烧灭菌。将左手试管移至火焰旁，用右手的小指、无名指和手掌，在火焰旁分别夹下两试管的棉塞，将试管口在火焰上稍微烤一下，以杀灭管口上的杂菌，随后将管口移至距火焰1-2厘米处， 用冷却了的接种针将母种纵横切割成许多小方块，然后挑取一小块，迅速移入被接咱的试管斜面的中前部，轻轻抽出接种针，再烤一下试管口，迅速塞上过火焰的棉塞，如此连续操作，１支母种一般可扩接试管30-40支。 技术要点：整个操作过程均须在火焰旁进行无菌操作，母种上的接种块以及周边已老化的世界经济 要移接扩管，尽量挑选菌龄短的菌丝块进行生产。
８、贴标签培养：试管从接种箱取出之前，应逐支试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期，随后把试管置培养箱（室）中24℃下培养。
二、二级种的生产
二级种是由一级种繁殖而来，常称为原种主要用于繁殖三级种（栽培种），以满足大量繁殖栽培种的需要。
１、培养基配制
（１）粪草培养基：
①配方见上述；
②制作：把发酵麦秆切短，大约为3-5厘米,加入粉碎牛粪粉,麸皮,石膏,碳酸钙,石灰,充分拌匀,加水调湿使培养基均匀吸水至含水量达65%左右,随后铲成一堆让培养基水分平衡2-3小时,即可装瓶。
（２）发酵牛粪粉培养基
①配方见上述
②制作：发酵后晒干牛粪粉经过粉碎过筛（筛孔0.5×0.5厘米），拌入碳酸钙，用1%石灰水调整含水量达65%左右,pH值约为8.5,堆成一堆使牛粪粉水分平衡, 装瓶前再搅拌均匀。
（３）发酵棉籽壳培养基
①配方见上述
②制作：棉籽壳80% ,牛粪粉20%,石膏1%,石灰2%,混匀后加水调湿含水量达70%, 进行建堆发酵,堆宽1.5米,高1.2-1.5米,长度根据数量而定,当料温达65-70 ℃时可进行翻堆,一般3-4天翻一次,每次翻堆时应补充1%石灰水,含水量控制在65-70%之间, 经过4-5次翻堆,棉籽壳长满大量高温放线菌而腐熟,这时已适合蘑菇菌丝的生长,腐熟棉籽壳晒干备用。制种时把腐熟棉籽壳按配方要求与其它辅料充分拌匀，用１％石灰水调节含水量达65%左右，堆成一堆使水分充分平衡均匀， 装瓶前再搅拌均匀即可。
（４）羊粪粉培养基
①配方见上述
②制作同发酵牛粪粉培养基
（５）矿石培养基
①配方见上述
②制作：把培养料混合均匀，用１％石灰水调整含水量达60%左右,搅拌均匀即可装瓶。
