灵芝菌种的分离方法有组织分离法、孢子分离法以及基质内菌丝分离法。这3种分离方法各有特点：基质内菌丝分离因易污染较少采用；孢子分离法又称有性繁殖，一般在研究及菌种复壮时采用；一般大规模生产时常采用组织分离法，该操作简便，且能保持原有菌种的优良品性。
一、子实体组织分离法
选取形态发育正常、无病虫害、未弹射灵芝孢子的灵芝子实体，菌盖边缘尚在生长的黄白色子实体。它们具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，属于无性繁殖范畴。组织分离取材广泛、操作简便、易于成功，是灵芝纯菌种的简便分离方法。
1、幼蕾分离 切取灵芝菌柄先端膨大的幼蕾，在无菌条件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼烧后的刀片从柄部浅切1刀，掰开两半后用锋利的接种刀挑切取幼蕾内菌肉1小块，移接至斜面中央，28℃下遮光培养，菌丝长满斜面即为母种。
2、菌盖分离 选取子实体生长正常、健壮和未成熟的子实体，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在菌盖边缘黄白色生长圈处，切破皮壳，掰下一块幼嫩菌盖，用灼烧后的解剖刀在断面菌肉上作纵横切割成米粒大的组织片，置无菌培养皿内，最后用接种刀将组织片移接至斜面上，28℃下遮光培养。整个操作需严格无菌条件下进行。
未形成灵芝菌盖的幼嫩芝柄亦可作为分离材料。
二、灵芝孢子分离法
孢子分离法从灵芝子实体中收集成熟的有性担孢子，并将其培养萌发成纯菌丝的方法。由孢子分离得到的菌丝具有菌龄短、生活力强，同时有性孢子具有双亲的遗传特性，是选育新菌株和杂交育种的材料。但是孢子分离污染率高，经及时清理污染的试管。
1、孢子的采集 以赤芝为例，选取个体典型、菌盖呈红褐色、有光泽、发育成熟、无白色生长圈，瓶(袋)上见有少量散落孢子粉，大小适中，无病虫害的子实体，切去菌柄，用棉球蘸取0.1%升汞溶液，反复擦拭菌盖正反面，菌孔一面宜轻，然后用无菌水充分冲洗，并以无菌纱布吸干水分。孢子采集方法有以下几种：
①、弹射法 在无菌条件下，用灼烧后的粗注射针将切去灵芝菌柄处钻1个深达菌肉的小孔，插在培养皿的铁丝架上，培养皿放在铺有纱布的搪瓷盆内，外罩上钟罩或无底蘑菇瓶，置28－30℃相对湿度90%的条件下培养。当有大量褐色灵芝孢子粉落入培养皿后，除去钟罩及支架，将培养皿盖好，并用透明胶带封贴或无菌纸包扎备用。所用器材均需事先用纸包扎灭菌并进行无菌操作。
②、贴附法 锥形瓶(即三角烧瓶)内分装入1cm厚的PDA培养基，加棉塞灭菌，冷却成平板。无菌条件下将去柄的子实体如上述作表面消毒处理，放在无菌纸上，沿菌管方向切若干个小块，然后拔出锥形瓶塞，将子实体小块的皮壳部蘸上胶水粘贴在棉花塞底部，塞回锥形瓶口上。置28-30℃下培养，见有棕色孢子下落在培养基表面，即可在无菌条件下除去棉塞上的菌块。
贴附法也可粘贴在试管斜面正上方的管壁上。若菌盖厚可削去部分皮壳和菌肉，见斜面上散落有孢子时，除去菌块。
2、菌丝培养 在无菌条件下，把弹射法收集到的孢子，用接种环蘸取少许抖落在斜面上，或将孢子少许放入试管内无菌水中(采用20%灵芝子实体煮汁更理想)制成孢子悬液，然后蘸涂在斜面或平板上，置28－30℃下培养。贴附法在平板或斜面上接收的孢子，可直接适温下培养，约1周，待孢子萌发后，挑取萌发早、长势旺的菌落，移接至新斜面上，经培养即为母种。
野外分离灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射入培养基后及时转管。
孢子萌发后先形成一级菌丝，几天后便可形成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般可确定为得到了灵芝菌丝。
孢子分离得到的菌种，由于其变异性较大，所以不应直接用于大面积生产，而是选择具有该品种其优良性状的后代进行组织分离后再用于生产。
