2、单孢分离 就是将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法，单孢子分离的方法，按分离的手段可分为以下三种。
（1）稀释分离法：这是通过不断稀释孢子悬浮液，使孢子分散最终孢子浓度控制在300-500个孢子/毫升，吸取0.1毫升的孢子液注入平板均匀涂布，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如下：
①制备无菌水试管：取10支试管，其中1支装100毫升蒸馏水，其它9支装9毫升蒸馏水，经高压灭菌即成无菌水。
②制孢子悬液：取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入10毫升无菌水试管中， 摇振使孢子分散成悬液，用无菌1毫升移液管吸取1毫升孢子悬液于第2支试管中， 摇振使其分期，再从第2支试管中吸取1毫升注入第3支试管中， 如此反复稀释直到孢子浓度达到300-500个孢子/毫升，备用。
③制培养基平板：配制PDA培养基，装入三角瓶中进行高压灭菌， 准备倒平板的培养皿也经过高压灭菌备用，待已灭菌的PDA冷却至50-60℃时，在无菌操作下倒15-20 毫升PDA至培养皿中，培养皿放平，昼使培养基表面光滑，厚度一致。
④孢子涂布：在无菌操作下，吸取0.1毫升的孢子悬浮液滴在平板培养基表面上，使用T氏棒把孢子均匀涂布在平板上，盖上刺激菌丝培养皿，放置于24-25℃恒温箱中培养。
⑤挑选单孢子萌发菌落：一般孢子经过５天的培养开始萌发长出菌丝，培养皿经过显微镜的镜检确定孢子萌发的菌落是由单个孢子萌发成长而成的，可使用打孔器进行打孔把该菌落移接至新鲜的PDA斜面试管中继续培养。 打孔器的外径应小于显微镜的视野范围，而且打孔之前须检查该菌落周围是否有孢子或其它菌落，昼使打孔不会触及周边的孢子或菌落，确保纯种。
（2）毛细管法：孢子悬浮液经过稀释，使用毛细滴管把孢子悬浮液滴一小滴于皿盖内，昼使每一滴只含有一个孢子，从而达到单孢子分离，其方法如下：
①孢子悬浮液制备同稀释分离法，孢子浓度控制在200-300个孢子/毫升。
②毛细滴管制备：取洁净的玻璃管在酒精喷灯上先拉成外径1毫米的细管， 稍冷却后再加热并迅速拉长，使管尖内径约200微米，剪断即成毛细滴管，在滴管后端塞棉花， 装入消毒盒中后进行灭菌备用。
③点样镜检：用毛细滴管吸取经稀释的孢子悬浮液约0.1毫升(可滴30滴)，在无菌操作下，快速点于皿盖内壁的标记圈中央，滴液应小于低倍镜的视野， 点样后的培养皿仍盖在有水琼脂的皿底上，贴胶布固定后再用低倍锐检查皿盖内壁的的液滴，确定是单孢者，即在皿盖上标上记号。
④培养基推贴及刺激培养：使用接种针取一小块PDA培养基(约2×2毫米方块) 推贴至标记为单孢子的液滴，使液滴中的孢子能够吸附到培养基边缘。 将事先培养好蘑菇气生菌丝的平板培养皿盖取下，套在菌丝平板的底部，再把已分离并推贴好的培养基的皿盖罩在套有菌丝平板的玻璃皿上，使两个皿盖对接，贴胶布封口(要留0.5厘米缝用作通气)，这样就形成一个刺激单孢子萌发的培养室，置培养箱中24 ℃下培养，待单孢子萌发，及时撕下胶布，用接种铲挑取已萌发的单孢菌丝贴块，移接到新鲜PDA斜面试管中，置24℃恒温箱中培养，即可区得单孢纯种。
