2.1.3 栽培
人工栽培时掌握温度:孢子弹射时30℃,菌丝体生长20-28℃,10-20℃形成菌核,14-25℃形成子座,26-32℃长出地面。湿度控制:菌丝体生长60%-70%相对湿度,10%-20%形成菌核,孢子弹射、子座形成及长出虫草以60%一80%为宜。光照控制:孢子萌发和菌丝生长不需光照,但从无性阶段到有性阶段,需一定程度的散射光,刺激长出于座。另外,只需小量空气即可。pH以5-6为宜。 2.2 人工栽培 即栽培的各个环节均在人为条件下完成,冬虫夏草的人工栽培,包括种子液制备、场地选择及栽培3个步骤。
2.2.1 种子液制备
悬浮液的配方为:马铃薯200g,磷酸二氢钾3 g,硫酸镁1.5 g,维生素10mg,增产灵0.5 mg。将孢于接种后,于24-28℃下培养。
2.2.2 场地选择
室外栽培选择土壤疏松、含沙量较大、通气良好的地方作栽培场,室内栽培用木板作成多层床架,上铺7 cm沙土,湿度保持在40%,用树叶铺盖。
2.2.3 接种培养
接种时间选蝙蝠蛾幼虫发育到二龄时进行,在阴天或太阳下山后,用微型喷雾器喷到幼虫体上。6-7月后,即可看到子座顶端露出土面。也可用瓶子等装菜园土栽培。 我国沈南英(1985)把虫草头孢菌接种于特殊培养基一肉水500mL、水解蛋白5g、酵母1 g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾1g、蒸馏水400mL,长出了颜色、形态与冬虫夏草一样的子座。四川中药研究所在产区康定,调查样方1 000余个,采集样本1 200余份,观测幼虫20多万头,实验1 500余次,终于用康定虫草菌接种人工饲养的贡嘎蝙蝠蛾幼虫,成功地完成世代繁衍,人工培养出冬虫夏草。
3 冬虫夏草的液体深层发酵
由于天然虫草严格的寄生性以及特殊的生态环境,故其产量很低,资源紧缺。市场供需脱节,价格高昂,大约6 000元/kg,目前市场出售约10 000元/kg以上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液,是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。实验表明,人工发酵培养得到的菌丝,经毒理、药理、植化研究,证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致,可代替天然虫草生产虫草制品,以弥补自然资源的短缺。据食用菌生物技术1989年国际会议报道,虫草菌丝体液体培养产率最高可达4%左右。 据报道,国内有30多个单位的科学工作者在进行冬虫夏草的人工培养及采用其无性阶段的发酵物,代替野生冬虫夏草的研究方面已取得较为理想的结果。尚德静等通过对冬虫夏草的深层发酵条件,如pH、培养温度、接种量、转速及对深层发酵培养基碳氮源和无机盐的筛选,确定了其最佳发酵条件为24℃、200 r/min、pH 5.0、接种量5%-15%,菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨和氨基酸复合粉,最佳无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙。 江晓路、葛蓓蕾对一株北虫草苗Y3的液体深层发酵条件进行了研究,确定了以土豆汁 20%、蛋白胨8‰、蔗糖20‰、磷酸氢二钾1.5 ‰为主的发酵培养基,培养条件为:温度25-26℃,转速125 r/min,接种量5%,摇床振荡培养4~5 d。获得了菌丝平均得率为1.8%的较高水平。 李信、许雷、裴鑫德采用二次回归通用旋转组合设计方法,对蛹虫草菌丝体液体发酵培养基的最佳组合进行了研究,建立了培养基的反应模型,并用实验数据验证了数学模型,对培养基最佳优化组合的各种因子、影响产量的反应规律及交互作用进行了探讨,并在此基础上进行了蛹虫草菌丝体液体发酵条件的研究。结果表明,蛹虫草菌丝体液体发酵的最适条件为:接种量为6%,发酵初始pH 7.0,培养基装量100 mL/500 mL三角瓶,发酵温度24~28℃,发酵周期96 h。 张长凯等对虫草菌丝生长的深层培养条件进行了详细的研究,筛选出虫草菌丝深层培养的最优条件:葡萄糖1.5%,麦芽汁1%,蛋白胨1%,酵母膏 0.5%,pH 6.0,温度23℃,接种量5%-10%,摇床转速80-90 r/min。 陈传盈等为提高冬虫夏草深层培养干菌粉得率、蛋白质和甘露醇含量,对其培养条件进行了研究,试验表明,6%的白糖、2%的蚕蛹粉、1%的酵母粉和0.3%的2号无机盐添加剂等组成的液体培养基,可获得干菌粉得率4%-5%,粗蛋白含量>43%,甘躇醇含量>8%。 钟士清通过发酵条件研究得出,其发酵生长适宜温度为26-28℃,适宜pH值在5~7之间,接种量以5%(体积与体积比)为佳。30h后菌丝达最高生长量:27.7g菌丝体干重/L。整个发酵过程中,对发酵通气量要求不高。 张显耻、何道珍探索出发酵工艺为:原种-摇床培养-一级培养-二级培养个三级培养-四级培养-菌液分离-干燥。具体结果为:①摇床培养:接种量为一支试管菌落接一个三角瓶(250 mL/1 000 mL),转速100 r/min。初期培养液棕红,无气泡产生,随培养进行,色渐变浅呈棕黄,继续培养又呈棕黑,肉眼可观察灰白色菌丝,镜检可见菌丝片段和分生孢子发芽形成的菌丝。这阶段为15 d左右。②一级培养:接种量为8%-10%,前3 d压力为0.2~0.3 kg/cm2,以后压力逐渐增大,第5 d肉眼可见翻腾的小颗粒比原料略多,气泡占液面的50%,8 d后压力升至0.5-0.6kg/cm2。10d后停止通气,测得菌液比达70%。终止培养,菌丝球结构紧密,表面光滑,色灰白。③二、三、四级培养:培养情况和一级大体相似,但培养时间明显缩短,为7-8 d。