作物物理诱变新技术研究进展
林 彤 欧 琳
（福建师范大学，福州 350007）
摘 要 概述了激光生物工程技术和离子束注入技术的作用机理、特点和产生的生物学效应，及其在作物诱变育种中的研究与应用。
关键词 作物诱变 激光生物工程 离子束注入
选育优良品种是促进农业生产发展的必由之路。大量研究和生产实践表明，诱变育种可克服常规育种周期长、进程慢、难以获得突变性变异品种的缺点，可在创造作物新种质、新材料和解决育种工作中某些特殊问题取得突破和高速发展，继γ射线、中子、EMS、NaN等传统的理化诱变手段之后，激光技术和离子束注入技术在探讨诱变育种新途径方面的应用，成为极为活跃的研究领域。激光生物工程的崛起与离子束注入技术的发展，将有力推动植物基因工程在育种上的应用，使诱变育种工作提高到一个新的阶段。
1 激光生物工程技术
1.1 激光微束技术 利用激光亮度高、光谱纯、可调谐、发散角小等其它光源没有的特点，将激光束用光学系统加以聚焦，形成非常细的光束，光斑直径小到几微米，甚至十分之几微米，称为激光微束。激光微束在细胞内聚焦，不破坏细胞膜，却能对细胞核和细胞器进行操作，如可去掉细胞壁，进行细胞融合、切割染色体等，因此被认为是光刀。60年代末，Berns等开始用激光微束进行了一系列研究，1970年证明激光微束可诱发染色体畸变。中国科学院遗传研究所也进行了大量工作：胡应和（1982）等用激光诱发微核仁的形成，梁宏等用激光微束引起核仁缺失，得到具有单核仁的细胞，成功率在50%以上。近几年国内外的研究趋势是激光微束在高等植物特别是农作物上的应用。我国的梁宏、陆仲康等以农作物种子根尖细胞为材料，首先报道了用激光微束切割高等植物的染色体，成功地把蚕豆、小麦、玉米和大麦染色体切割成4～12片段。并且建立了激光切割植物染色体的实验技术，为进一步把这一技术方法应用于植物染色体工程、基因定位及植物染色体片断DNA的微克隆打下了基础。
1.2 激光细胞融合技术 利用物理或化学的方法将两个相互接触的细胞融合为一个细胞的技术称为细胞融合,是细胞工程的重要内容之一,是一种在细胞水平上的遗传操纵。若两个细胞贴在一起,用高峰值功率密度激光对细胞接触处的质膜进行辐照,质膜发生光击穿,可产生微米量级的微孔,由于质膜上的微孔是可逆的,质膜分子在重组过程中借助细胞连接处小孔的表面曲率很高，处于高张力状态，细胞逐渐由哑玲状变为圆球状，细胞就融合了。1987年Wiegand等报道了激光诱导油菜原生质体融合的结果，1992年中国科学院大连化学物理研究院等试用金盏菊叶肉细胞原生质体探索激光诱导植物体细胞融合的方法，取得了初步成功。激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：（1）能选择任意两个细胞之间进行融合；（2）因仅在两个细胞的接触点照射激光，故作用于细胞的应力和障碍小;（3）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；（4）能适时观察融合过程。
1.3 激光导入外源基因 利用人工方法从一种生物中提取某种基因，注入到另一种生物细胞内，并被细胞接受，经培育生长而具有预期的变异性状的一种生物，此种技术称为外源基因转移技术。1987年联邦德国的Weber报道了用激光微束单脉冲照射将DNA直接导入油菜细胞和叶绿体。中科院王兰岚等人及清华大学沈子威等广泛地选用了不同科属植物及不同种的植物进行外源基因导入，研究结果表明，激光微束转化法可广泛应用于各种植物，而且对细胞的损伤小，转化频率高，实验程序简便，重复性好，并能准确地定位于被照射细胞，对不同种的植物细胞可通过控制脉冲次数来调节能量。经激光微束处理的细胞可不加抑菌的抗生素以免除对细胞的损伤。1993年王兰岚等人又报道了利用微束激光将外源基因导入小麦幼胚并获得转基因植株。被认为是世界首例。1995年美国贝克曼激光研究所也报道了将外源基因成功地转入水稻而培育成基因工程植株。此外，对细胞中的叶绿体打孔，将DNA导入细胞器中也成为一种实用技术。利用激光给油菜的离体叶绿体打开一个临时性小孔，可将外源DNA整合到此细胞器中并被吸收，基因能在处理过的细胞或细胞器上表达。激光微束法导入外源基因的成功，为高等植物特别是重要粮食作物的遗传转化开辟了一条新途径。
2 离子束注入技术
离子束注入生物学效应是我国科技人员于80年代中期发现并迅速投入诱变育种应用的新研究领域。离子束注入种子，诱变后种子损伤轻，突变率高，突变谱广，有助于培育高产、优质、多抗的新品种。由于离子束注入具有高激发性、剂量集中和可控性，可进行定向诱变，已成为当代植物改良和作物育种的一种新的重要手段。
2.1 作用机理 能量为几十至几百KeV的荷能离子通过发生器注入生物体内，在其到达终位前，使同靶材料中的分子原子发生一系列的碰撞。它们之间相互作用的过程随着离子能量逐渐降低而变化。起初以非弹性碰撞过程为主，使生物分子电离或激发导致电离损伤。随之弹性碰撞起主要作用，导致靶原子移位，留下断链或缺陷。当入射离子能量损失达到峰值，慢化的原初离子将以高斯分布的形式沉积下来。如果注入离子是活性离子，则它们在沉积过程中将不断与生物分子键合、置换，形成新的分子基团。伴随着入射离子的能量沉积，其中一小部分能量将随着动量方向到达表面，引起生物体表面的二次离子发射，即溅射。特别指出的是在离子注入与生物体相互作用的峰值范围内其相互作用是局部的，双重的和不易修复的。因此，离子注入用于作物诱变有可能在损伤轻的情况下获得较高的突变率和较宽的突变谱。
2．2 生物学效应及育种研究 离子束注入具有显著的生物效应。在各种植物处理中不仅可以发现染色体结构变异，而且发现了三级和四级连续易位等高级结构变异。染色体畸变类型和频率与注入离子种类、剂量以及生物体部位有关。离子束注入引起细胞壁剥离，细胞排列紊乱，形状变化巨大，细胞被拉长、扭曲和绞链，细胞间质基本上被蚀，留下很深的沟槽和孔洞。离子注入可引起生物体多种生理变化损伤，如导致叶绿体畸变，引起呼吸代谢、过氧化物酶、自由基以及自由基清除酶等的变化。
目前，离子束注入植物品种改良已涉及几乎所有主要的粮食和经济作物。据悉，已育成的两个水稻新品种晚D9055和S9042米质优、抗性好，1994年累计推广应用3多万hm2，郑冬官等利用离子束注入棉花种子，选育出4个高产、优质、抗病虫和早熟新品系，其中一个早熟新品系已经进入省级区试。吴跃进等把离子束注入温敏型水稻的当代，选育出黄花叶水稻突变体。蔡得田等利用N+离子注入水稻无融合生殖材料，使后代无融合生殖率从14%提高到48%，获得了高频无融合生殖水稻HDAR001。安徽农业大学利用离子束处理玉米种子获得了高光效的多穗型材料，为玉米高产育种提供了一种珍贵的基因资源。1990年以来，安徽农科院等利用离子束介导的植物转基因技术已将Gus基因导入水稻和棉花带壁细胞，并将外源赤霉素抗性基因（hph）导入水稻种胚细胞，获得了转基因植株。低能离子束介导外源基因转移直接利用种子胚做外植体，省去了原生质体制备和再生植株的麻烦，便于大量操作和取材，为植物，尤其是农作物基因工程注入了新的活力。
此外，利用空间条件引起植物遗传性变异的空间诱变手段也正处于积极的研究探索阶段，也已显露出诱人的前景。上述的几种物理诱变新技术实验验证与育种应用之间的周期大为缩短，是现代科学技术发展的结果。然而，这些诱变手段的应用与研究还刚刚起步，能否高效率诱变出使用传统因素难以获得的突变体或迄今自然界罕见的种质材料，最终成为新的诱变源和诱变因素，有待于在理论机制方面进一步验证，在育种实践中进一步探索。随着科学的发展和各学科的互相渗透，这些新的诱变手段将不断完善和发展，为农业增产作出贡献。
