灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子基因组RAPD分析
王淑珍?1 白 晨??2? 范 俊?1 高 雁?1 扬家峰?1 扬英杰?1
? （1 上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；
?? 2复旦大学生命科学学院， 上海 200433）
作为一种传统的滋补强壮、扶正固本的珍贵药用真菌，灵芝?(Ganoderma lucidum)几千年来一直被广泛用于临床治疗和人体保健。随着科学技术的发展，近10年来对灵芝的栽培、菌丝体工业化深层发酵及有效成分的研究逐渐深入。随着分子生物学和微生物遗传学 研究的进展，应用原生质体融合技术进行灵芝种内原生质体融合的研究，以期获得优质高产的灵芝菌株。然而，这些研究主要集中在栽培、有效成分、药理及临床应用方面，未见通过 遗传育种改变灵芝担子果木栓质化生物学特性的研究报道。现己发现，灵芝属近百种灵芝的担子果均呈软木质或木质化，这种组织结构不仅给灵芝的食用和药用带来许多加工工艺上的 麻烦，而且由于木栓质化，使灵芝不能象其他肉质和革质食用菌那样食用，所以不可能做到物尽其用。即使是深层发酵的灵芝菌丝体，口感也近似软木质化结构，难以咀嚼，如果加 工成食、药用原辅料，微细化难度也远大于一般食、药用菌菌丝体。灵芝这种遗传特性限制了其应用范围。近年来，利用外源遗传信息改变遗传特性的方法已成为遗传育种中新的研究 焦点。若将外源DNA导入灵芝细胞，嵌入到细胞的遗传物质中，就有可能改变其木栓质化遗传特性。
?本研究旨在保持灵芝原保健功能的前提下，根据细胞工程和分子生物学理论，以肉质食用菌担子果为外源DNA供体，通过原生质体融合技术，探讨改变其木栓质化生物学特性的方法与技术。
1 材料与方法
?? 1.1 菌株
?灵芝CJL990菌株系长白山野生紫芝的诱变高产菌株［1］，由上海师范大学王淑珍研究组提供。糙皮侧耳农科2号，引自上海市农业科学院。融合子F3、F8，由上海师范大学王淑珍研究组根据其优良生物学特性初筛获得。
? 1.2 试剂
?12种引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，核苷酸序列见表1。
?表1 核苷酸序列及试验编号
Table 1 The experiment nos. and the nucleotide sequences of 12 primers
试验编号?Experiment nos.
核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide
试验编号?Experiment no s.
核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide
01
GGGTAACGCC
07
CTACTGCCGT
02
TGAGGGTCCC
08
TTATCGCCCC
03
GGTGCGGGAA
09
GAGTCTCAGG
04
GTGACATGCC
10
CACCAGGTGA
05
TCAGGGAGGT
11
CTTCACCCGA
06
AAGACCCCTC
12
TCACCACGGT
? LETS缓冲液组成：100mM LiCl 0.424g，10mM EDTA 0.372g，20mM Tris 0.242g，0 .5% SDS 0.5g。将上述试剂溶解在80mL重蒸水中，用盐酸调节pH至7.8～8.0，定容至100mL，加入蛋白酶K，至终浓度为50mg/100mL。
?50×TAE缓冲液组成：Tris 242g，冰醋酸57.1mL，0.5M EDTA(pH8.0)100mL，加蒸馏水至 1L。
?上样缓冲液组成：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝。
?苯酚∶氯仿∶异戊醇：于50mL水饱和苯酚中加入24mL氯仿和1mL异戊醇，使其配比为25∶2 4∶1。
?1.3 总DNA的提取??［2，3］?
?菌株接种于液体培养基中，于26℃培养10d后，过滤收集菌丝体。取0.1g菌丝体，无菌重 蒸水淋洗后用滤纸吸干，放入1.5mL的离心管中，每管加400μL LETS缓冲液，并用研棒研磨菌丝。加500μL苯酚、氯仿、异戊醇混合液（25∶24∶1），充分混匀，14000r/min离心10 min。取300μL上清液于一新的离心管中，加600μL(2倍体积)无水乙醇，混匀，14000r/min 离心10min，去上清液，真空干燥沉淀物后加40μL无菌重蒸水，溶解，用华舜公司的植物总 DNA抽提柱过柱纯化，70%乙醇（或Wash Buffer）离心洗涤两次，最后加20μL无菌重蒸水，于65℃洗脱。取1μL纯化后的总DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲系统中电泳检测 。
?1.4 RAPD反应
?模板DNA定量：用紫外分光光度计测定提取的不同菌株的DNA浓度，稀释，使其终浓度为5～10ng/μL。
?RAPD反应体系： 反应体系的总体积为25μL， 其组分为2.5μL 10×PCR Buffer ， 2μL2mM MgCl?2，1μL DMSO，1.5μL dNTP，1μL Taq酶（Sangon），5μL随机 引物（3.3ng/ μL），1μL DNA稀释模板（以ddH2O为空白对照），11μL ddH?2O。
?反应条件：反应在MJ Research PTC?225 PCR仪上进行。扩增反应程序为：94℃ 变性5min，92℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，共进行45个循环，最后72℃补平 10min，终止温度为4℃。
?产物检测：取10μL反应液，加2.5μL电泳样品缓冲液，在1×TAE电泳缓冲体系中，用?1 .4％?琼脂糖凝胶电泳分离DNA扩增片段，EB染色，于凝胶分析仪下观察结果并拍照。
? 1.5 相似系数的统计
?对扩增DNA片段按相似率Sxy=2?Nxy/(Nx+Ny)×100%进行相似指数(Simi larity index)分析，其中Nxy是比较后两种材料x和y共有的DNA片段数目，Nx和Ny分别为材料x和y各自的DNA扩增片段数目。
2 结果
? 2.1 引物的筛选
?试验所采用的12个随机引物中，有4种引物能有效地同时对灵芝、糙皮侧耳及其融合子的D NA进行扩增，它们分别是07、10、11和12号引物。用这4种随机引物进行重复实验，扩增出 的随机片段大都在3.5kb～0.5kb之间(图1，图2)。
表2 4种随机引物的扩增谱带
?Table 2 The amplication bands with 4 random primers
供试材料?Materials tested
谱 带总数Total no.?of the bands
GFP共同谱带GFP common?bandsGP
GP共同谱带 GP common?bands
GF共同谱带GF common?bands
FP共同谱
FP common?b ands
灵芝?G.lucidum? (G)
52
--
12
--
--
融合子 Fusant (F3)
57
9
--
35
12
融合子 Fusant (F8)
60
15
--
32
20
糙皮侧耳 ?P.ostreatus? (P)
40
--
12
--
--
? 1～6号泳道分别为G、 F3、 P、 G、 F3、 P用不同引物的扩增结果
?M为分子量标记，从上到下依次为10kb、 8kb、 6kb、 5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 1.5kb 、 1kb和0.5kb，N为空白对照
?Lanes 1～6 are the amplicons of G，F3，P，G，F3，P amplified with different pr imers
?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb resp. N： The blank contrast
?
图1 融合子F3的RAPD分析?Fig.1RAPD analysis of fusant F3
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? 1～6号泳道分别为G、 F8、P、G、F8、P用不同引物的扩增结果
?M为分子量标记，从上到下依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb 、1kb和0.5kb，N为空白对照
?Lane 1～6 are the amplicons of G，F8，P，G，F8，P amplified with different pri mers
?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb，resp. N： The blank contrast
?图2 融合子F8的RAPD分析?Fig. 2 RAPD analysis of fusant F8
? 2.2 四个样品扩增谱带相似率
?根据表2的数据计算F3、F8两融合子与两亲本的相似系数：SGF3=64.2%，SGF8=57.1%；SPF3=24.7%，SPF8=40.0%；SGP=26.1%。
? 2.3 融合子和亲本株扩增的谱带类型
?从图1和图2扩增结果可见，灵芝与糙皮侧耳相同的谱带较少(S??GP?＝26.1%)。二株融合子的平均SGF＝60.65%，而SPF＝32.35%，可见，融合子的生物学特性与灵芝更接近。
3 讨论
?3.1 本研究所制备的灵芝和糙皮侧耳原生质体，是采用双层培养法进行原生质体再生［4］，将灵芝和糙皮侧耳两亲本对潮霉素自然抗药性的差异结合原生质体灭活［ 5］作为融合子筛选的依据。
?3.2 根据RAPD原理，每种随机引物扩增的1条谱带代表了被扩增的基因组中的一个遗传位点。因此，本研究中四种随机引物总共检查了灵芝的52个位点，两株融合子的117个位点（平均每株58.5个），糙皮侧耳的40个位点，表明融合子与两亲本基因组中的遗传位点总数有差别。
?3.3 灵芝与糙皮侧耳为不同目的大型药用菌与食用菌。灵芝属多孔菌目，灵芝属；糙皮侧耳属伞菌目，侧耳属。两者亲缘关系较远，其基因组内的同源序列较少，只有当引物结合 位点之间的序列区段在两亲本之间同源时，PCR扩增产物的带型才会相同，从扩增结果来看，相同的谱带较少（SGP=26.1%），差异明显（图1，图2）。
?3.4 融合子的谱带有的与灵芝相同，有的与糙皮侧耳相同，其基因组DNA既有与灵芝同源的序列，又有与糙皮侧耳同源的序列。笔者对灵芝、糙皮侧耳原生质体融合子基因组进行了 RAPD分析。初步证实，该融合子确为两亲本原生质体融合后的融合子，将在此基础上进一步做分子杂交［6，7］试验。
?3.5 根据Williams等（1990）的实验，RAPD符合孟德尔遗传规律，虽然本实验中发现双亲的共有谱带基本上都可在融合子中找到，部分单亲谱带也出现在融合子中，但融合子的谱 带不是双亲谱带的简单叠加，融合子中还出现了新的谱带（图1，图2），这可能是融合后基因重组引起引物结合位点改变的结果。如果将融合子扩增谱带分别与两亲本作比较，从融合 子与两亲本的相似系数来看，两株融合子的平均SGF为60.65%，而SPF为32.35% 。可以看出融合子与灵芝更为接近，符合我们的育种目的。
?3.6 有关灵芝木栓质化生物学特性改变与否及改变程度，目前仍在研究。
?? 参 考 文 献
? ［1］ 王淑珍，白 晨. 灵芝孢子诱变与菌丝高长速菌株选育［J ］.中国食用菌，2000，106（6）：6～9.
?［2］ Lee SB, Taylor JW.Isolation of DNA from fungal mycelia and singl e spore.In: PCR Protocols:A guide to methods and applications (Gelfand MA , Sninsky DH, White JJ, TJ Eds.)［M］. New York：Academic Press，1990,282～287 .
?［3］ Sobral BWS, Honeycutt RJ. Hight output gentic mapping of p olyploids using PCR?generated markers［J］. Theor Appl Genet，1993，86:105～11 2.
?［4］ 李 刚，李宝健.影响灵芝原生质体再生的几个因素［J］．食用菌学报，1998，5 （3）：12～17.
?［5］ 彭卫宪，陆大京.用灭活原生质体融合进行高温香菇育种［J］.真菌学报，1987，6 （3）：184～192.
?［6］ 陈明杰，谭 琦.应用RAPD技术对香菇融合菌株进行遗传鉴定［J］. 食用菌学报，1997，4（4）：17～20.
?［7］刘国振，刘振岳，贾建航，等.用RAPD方法对平菇、香菇属间原生质体融合 子的研究［J］.遗传，1995，2（1）：7～11.
