双孢蘑菇杂交菌株As2796家系的分子遗传研究
王泽生 廖剑华 陈美元 曾伟 宋思扬
摘 要：应用PCR和凝胶电泳等技术，对双孢蘑菇杂交菌株As2796及其亲本和子代作分子遗传标记跟踪分析，结果如下:1)总DNA的RAPD分析表明，随着遗传代数的增加，杂种子代和出发异核体亲本间的遗传差异逐渐增大;2)mtDNA的酶切图谱表明，亲本8213及其杂交子代具有相同的基因型，表明双孢蘑菇的mtDNA呈单亲遗传;3)Est同工酶的PAGE图谱表明，结合了亲本02高产特征和8213优质特征的杂交子代具有两个亲本的标记带型，证明Est同工酶标记是双孢蘑菇新菌株特性预测或鉴定的有效指标。
关键词：双孢蘑菇，家系，分子遗传，RAPD，线粒体DNA，酯酶同工酶
分类号：Q939.96 文献标识码：A
文章编号：1007-3515（2001）02-0233-0237
MOLECULAR GENETIC STUDY ON THE PEDIGREE OF HYBRID STRAIN AS2796 OF AGARICUS BISPORUS
WANG Ze-Sheng（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）
LIAO Jian-Hua（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）
CHEN Mei-Yuan（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）
ZENG Wei（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）
ZENG Wei（Department of Biology， Xiamen University， Xiamen 361005）
SONG Si-Yang（Department of Biology， Xiamen University， Xiamen 361005）
1 前言
双孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange(Imbach)]是世界性研究、生产和消费的食用真菌。自从荷兰育种家G.Fritsche首先于1981年育成商业杂交菌株U1和U3(Fritsche, 1983)并由Darmycel菌种公司投放市场以来,杂交菌株已经基本取代了传统的孢子分离菌株。在中国，福建省轻工业研究所于1983年开始双孢蘑菇的杂交育种研究,1986年以来建立起同工酶预测、鉴定新菌株等杂交育种技术(王泽生等,1989,1990,1991),先后选育出As376、As1671和As2796等系列杂交菌株,其中As2796明显结合了双亲本高产与优质的特征,成为中国最广泛使用的商业菌株,年产鲜菇超过30万吨(王泽生等,1995)。杂交菌株的育成和应用无疑使双孢蘑菇的生产水平和经济效益都得到显著的提高,但是对双孢蘑菇杂种优势的分子机理研究甚少。在使用多年以后，某些杂交菌株表现出对温度敏感或对轮枝霉病侵染敏感,子实体丛生等现象,导致产、质量下降等退化表现。那么这些退化现象的分子机理又如何呢?鉴于此,我们认为有必要对杂交菌株的家系进行遗传跟踪分析,以便进一步探讨双孢蘑菇杂交优势形成与退化的遗传基础,用于指导进一步的杂交育种和菌种保藏,预测新菌株可能形成的优良性状,监测新菌株在长期保藏后与生产使用中的性状表现,直接服务于生产。
此前，Fritsche于1987年发现U1菌株发生凹顶、空腹、硬开伞和单产下降等退化现象。为了复壮U1菌株,她采用原生质体克隆,多孢分离培养,单孢分离培养,并用原先的2个同核体重复杂交,发现U1的F2代单孢分离株表现出较大的变异性(1991)。 Khush等(1992)用RAPD技术作了双孢蘑菇遗传亲子的分析,Kerrigan等(1993)通过系统家系的构建,以DNA分子标记为辅助,分析标记在亲本及其子代中的分离情况,建立了双孢蘑菇遗传连锁图。本研究应用随机扩增多态性DNA(RAPD),线粒体DNA(mtDNA)酶切电泳和酯酶(Est)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术分析杂交菌株As2796的遗传家系。
2 材料与方法
2.1菌株
双孢蘑菇菌株02,8213,361-2,As165,W95-2,As2796和As4607由福建省轻工业研究所,
福建省蘑菇菌种研究推广站提供,它们的遗传关系如图1所示。
单孢分离
02────→361-2┐杂交 单孢分离 单孢分离
单孢分离 ├──→W95-2────→As2796────→As4607
8213────→As165┘
P Ps F1 F2 F3
异核亲本 同核不育株 杂交子一代 杂交子二代 杂交子三代
图1 双孢蘑菇杂交菌株As2796的遗传家系
Fig.1 The genetic family of hybrid As2796 of Agaricus bisporus
2.2 总DNA的RAPD分析
菌丝培养,总DNA提取,RAPD分析方法及所用试剂基本同前(曾伟等,1999),并参考朱衡等(1994),Khush等(1992)的方法。所用随机引物编号及核苷酸序列如表1。
表1 随机引物的商品编号及DNA序列
Table1 Commercial number and DNA sequences of Random Primers
编号
Number
引物序列(5’→3’)
Sequence of Primers
编号
Number
引物序列(5’→3’)
Sequence of Primers
OPU01
ACGGACGTCA
OPU16
CTGCGCTGGA
OPU03
CTATGCCGAC
OPU17
ACCTGGGGAG
OPU06
ACCTTTGCGG
OPU18
GAGGTCCACA
OPU12
TCACCAGCCA
OPU19
GTCAGTGCGG
OPU15
ACGGGCCAGT
2.3 mtDNA的酶切分析
2.3.1 试剂:RNaseA购自美国Sigma公司，限制性内切酶HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI购自德国宝灵曼公司，BamHI、EcoRI、Tris碱、饱和酚购自加拿大Sangon公司。其它试剂为国产分析纯。
2.3.2 菌丝培养:各菌株接在PDA液体培养基上，24℃静置培养15-30天。
2.3.3 mtDNA提取:参照廖剑华等人的方法(2000)。用两层纱布过滤液体PDA培养的菌丝体，加蒸馏水洗一遍，尽量挤干水分。称重后，按12ml缓冲液/10g菌丝体的比例加入预冷的BufferA(1.0M蔗糖，0.01m KH2PO4，0.1%BSA，2mM半胱氨酸，1mMEDTA，pH7.2 )，在高速组织捣碎机中充分破碎，1700g 4℃离心20min，上清用两层纱布过滤后，15000g 4℃离心20min，用20ml BufferB(0.6M蔗糖，10mM Tris-Cl，pH7.5，2mM EDTA)洗涤一遍，15000g 4℃离心20min，沉淀加2ml BufferC(10mMTris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，100mM NaCl，2%N-十二烷基肌氨酸钠) 混匀，加RNase至0.5mg/ml，30℃水浴30min，酚，氯仿/异戊醇各抽提一遍，加0.1V 3M NaAc，2V无水乙醇-20℃沉淀2hr，台式离心机收集沉淀，70%乙醇洗后吹干，溶于适量纯水中, -20℃保存备用。
2.3.4 酶切:用厂家提供的缓冲液，50ul体系，适量DNA和内切酶，适宜温度下酶解2.5hr，加EDTA至10mM终止反应。
2.3.5 电泳:按Sambrook等的方法。检测提取的DNA样品用0.8%琼脂糖，检测酶切产物用1.0%琼脂糖，电压5V/cm。EB染色照相。
2.4 Est同工酶的PAGE分析
菌丝培养、Est同工酶样品提取、PAGE方法及所用试剂均同前(王贤樵等,1989a,b)。
3.结果与分析
3.1 RAPD分析
本实验用9种随机引物对双孢蘑菇As2796家系的7个菌株的基因组DNA进行扩增,均得到阳性结果,将得到的所有电泳图谱进行统计,结果列于表2。聚类分析各菌株间的遗传相似值,根据公式(Nei等,1979):相似值S=2Nab/Na+Nb对表2中的数据进行聚类分析,换算出各菌株间的遗传相似值,并列于家系遗传构成图中(图2)。
表2 以02和8213为出发亲本的遗传家系中的各菌株间Nab/Na+Nb统计数据表
Table 2 Statistical data of Nab/Na+Nb between strains of the genetic family with parental strains 02 and 8213
Number
02
361-2
8213
As165
W95-2
2796
4607
02
361-2
33/98
8213
31/97
31/107
As165
21/79
25/89
25/89
W95-2
27/87
28/98
35/96
20/78
2796
27/91
32/101
32/100
35/82
35/90
4607
27/90
29/100
31/99
23/81
32/89
39/93
0.600
0.593
0.612
02(Type H)* 0.673 361-2（Type Hs）
0.571
0.639 0.562 W95-2 0.778 2796 0.839 4607
（Type HG4） （Type HG4） （Type HG4）
0.513 F1 F2 F3
8213（Type G） 0.562 As165（Type Gs）
P Ps
0.729
0.640
0.626
* 括号内所示为酯酶基因类型, Est gene types were shown inside the bracket.
图2 以02和8213为出发亲本的遗传家系构成及各菌株间的遗传相似值
Fig 2 The constitution of the genetic family with parental strains 02 and 8213
and the values of genetic similarity between different individual strain
实验结果表明:1.单孢同核体的泳带数量少于异核体,但也出现了某些异核体中没有的新带,单孢同核体与其异核亲本及杂种子代间的遗传相似值较低。2.子一代杂种W95-2与两个异核亲本02,8213之间的遗传相似值分别为0.621和0.729;子二代杂种As2796与异核亲本的相似值为0.593和0.640;子三代杂种As4607与异核亲本的相似值为为0.600和0.626。而W95-2与As2796的相似值为0.778,As2796与As4607相似值为0.839。这些数据表明,随着遗传代数的增加,杂种子代与出发异核亲本间的遗传差距逐渐增大,但杂种子代间的遗传相似值也逐渐增大。证明同核单孢杂交比传统的单孢、多孢分离筛选更容易产生优势明显的新菌株，杂交菌株的遗传特性可以通过单孢分离、筛选得以保持。
3.2 mtDNA酶切图谱分析
实验使用四种内切酶HaeⅢ(识别GG'CC)、CfoI(识别GCG'C)、MspI(识别C'CGG)、TaqI(识别T'CGA)对mtDNA粗提物进行酶切,获得的片段数达15-20条，接近纯mtDNA酶切的效果。图3、4显示了用CfoI和HaeIII酶切mtDNA的电泳图谱, 异核亲本8213及其杂种W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的线粒体基因型,而另一异核亲本02具有另一种基因型,表明双孢蘑菇的mtDNA呈单亲遗传,这和Sonnenberg(1991)的研究结果相一致。
图3 mtDNA粗提物的CfoI酶切图谱 图4 mtDNA粗提物的HaeIII酶切图谱
Fig 3 The digestion pattern of Fig 4 The digestion pattern of
crude mtDNA with CfoI crude mtDNA with HaeIII
1道: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 2道: 无酶对照; 3-7道: As2796, As4607, 8213, W95-2 和 02的酶切带型
Lane 1: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; Lane 2: non-endonuclease CK; Lane 3-7: patterns of As2796, As4607, 8213, W95-2 and 02.
3.3 Est同工酶的PAGE图谱分析
图5显示出发异核亲本02和8213分属H2型和G1型,而它们的同核单孢菌株361-2和As165保留了亲本的标记区带e2,e4和e1,e3,但其它区带数明显减少形成Hs1和Gs2型酶谱,杂种W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的Est酶谱,它们同时表达出双亲的标记区带e1,e2,e3,e4,呈典型的杂合态,被称为HG4型。上述结果表明,从异核亲本分离出同核单孢株到杂交形成杂种子一代,Est同工酶标记位点表现出遗传和重组,形成传统菌株(王泽生等,1989,1990)所没有的新的基因类型,并能稳定遗传给其单孢子代As2796(F2)和As4607(F3),与此相吻合的是亲本02的高产特征和8213的优质特征能通过杂交组合于杂交种W95-2(F1),其异核单孢分离株As2796(F2)和As4607(F3)保持了这种高产兼优质的特征,成为中国最广泛使用的商品菌株(王泽生等,1995),证明Est同工酶标记是双孢蘑菇新菌株特性预测或鉴定的有效指标。
图5 双孢蘑菇酯酶同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Fig 5 PAGE patterns of esterase isozymes of A.bisporus
8213(G1), As165(Gs2), 02(H2), 361-2(Hs1), W95-2(HG4), As2796(HG4), As4607(HG4)
4.讨论
应用RAPD、mtDNA和同工酶等分子标记技术对双孢蘑菇商业杂交菌株As2796的家系进行跟踪分析,使我们对同核单孢菌株间杂交产生的杂种优势的内涵及其遗传有了更多的了解。在现有商品菌株间杂交产生的变异是有限的,虽然可以获得更优良的菌株,但改良程度受到限制。因此,充分利用野生种质,或近缘种(大肥菇等)进行杂交就显得十分重要。
mtDNA是真菌中最主要的染色体外遗传物质,遗传方式独特。该遗传系统虽受控于核系统,但仍存在特殊的DNA复制机制,RNA拼接机制以及个别有别于"通用"密码子的遗传密码子。国际上对双孢蘑菇mtDNA的初步研究(Hintz等,1988;Sonnenberg等,1991;Jin等,1992)表明双孢蘑菇mtDNA存在3-4种基因类型,虽然这些多态性明显不如其它物种,但它和双孢蘑菇重要性状的关系仍然值得探讨。尤其是双孢蘑菇mtDNA呈现单亲遗传的现象在菌株改良中的应用。假如某一亲本的某一优良性状受控于mtDNA,那么利用单亲遗传特点,让这一亲本的同核体处于生长较快状态与另一亲本配对杂交,其子代就可能只承袭生长较快状态亲本的基因型(Jin,1994),达到改良的目的。反之若承袭的是不良性状的基因,那么菌株可能产生不如人意的退化现象。
福建省轻工业研究所于八十年代开展双孢蘑菇同工酶PAGE表型与菌株特性相关研究,并成功地把同工酶电泳技术应用于双孢蘑菇菌株特性的预测(王贤樵等,1989;王泽生等,1989,1990),根据电泳表型可把双孢蘑菇分为高产或H型,优质或G型,中间或HG1-2型,杂交或HG4-5型和同核不育或S型。近来又应用RAPD技术对三种重要类型菌株进行分析,获得相同结果,从另一角度证明了同工酶分型的可靠性(陈美元等,1998)。
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MOLECULAR GENETIC STUDY ON THE FAMILY OF
HYBRID STRAIN AS2796 OF AGARICUS BISPORUS
Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou,350005
Abstract: The family of the hybrid A.bisporus strain As2796 was analyzed through molecular genetic markers tracking. The results were as follows. 1.RAPD analysis of total DNA showed that with the addition of the number of genetic generations, the genetic differences between hybrid offspring and their original heterokaryotic parents increased. 2.The patterns of mtDNA digested by endonucleases showed that the hybrid offspring had the same mitochondrial genotype as the parent 8213, which indicated that the mtDNA of A.bisporus was inherited from one of the parents. 3.PAGE patterns of esterase isozyme(Est) showed that the hybrid offspring which combined both the characteristic of high yield of parent 02 and good quality of 8213 had the same marked bands of their parents. The Est isozyme marker was found to be an effective index of new strains’ characteristic prediction or determination of A.bisporus.
Key words: Agaricus bisporus, Genetic family, Molecular heredity, RAPD, MtDNA, Esterase isozyme
