【作者】赵春田 彭远义 唐国敏 王敖全 王华明
【机构】中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室 西南农业大学动物科技学院Genencor International Inc.PaloAltoCalifornia 北京100080 西南农业大学动物科技学院 重庆400716 北京100080 94304 USA
【摘要】运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl2/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。
【基金】Joint project granted by Genencor International Inc.of USA；
【关键词】同源重组; 外源蛋白; 分泌表达;
pepD 基因阻断菌株的构建(A)与 PCR 检测(B)示意图
pepD 基因阻断的测序结果示意图